Método de obtenção de DNA Fingerprint AmpFLP

AmpFLP, ou Polimorfismo de Fragmento Amplificado, é outra técnica que utiliza PCR para replicar o DNA. Esta técnica foi posta em pratica durante a década de 90, ela e mais rápida do que a RFLP.

Como a RFLP, ela começa com o uso de uma enzima de restrição. Depois, os fragmentos são amplificados usando PCR e separados por eletro forense em gel. As bandas podem ser visualizadas através da coloração prata do gel. Vantagens:

A AmpFLP leva a vantagem de poder ser automatizada e não custar muito, comparada às demais técnicas.

Devido ao seu custo relativamente baixo e facilidade de configuração e operação, a técnica  é bastante útil para países de baixa renda.

Método de obtenção de DNA Fingerprint STR

A PCR é o primeiro passo na análise das STRs (Repetições Duplas Curtas), que são alelos muito pequenos e específicos em uma repetição dupla de número variável (VNTR). Alelos são pares de genes que ocorrem alternadamente em um ponto específico, ou locus, de um cromossomo.

 Analisar STRs permite mais precisão que a técnica RFLP porque o pequeno tamanho torna mais fácil separá-las e distingui-las. 

Uma variação da análise de STR é a Y-STR. Somente STRs encontrados no cromossomo Y (que apenas os machos portam) são analisadas. A análise de Y-STR é útil caso a amostra contenha DNA combinado (de homens e mulheres) ou em casos de agressão sexual nos quais um homem é o agressor. A Y-STR é fora isso, processado como uma STR normal.

Método PCR

O método PCR na verdade possui uma função diferente do RFLP, ou seja, esses dois métodos podem se complementar o PCR serve para quando a amostra esta presente em pequenas quantidades, e assim utilizamos esse método para criar réplicas dessa amostra e aumenta o seu tamanho permitindo uma análise mais profunda (como por exemplo, o próprio fingerprinting do método RFLP). O nome PCR vem do inglês “Polymerase chain reaction” ou “Reação em Cadeia pela Polimerase”.

A técnica explora uma enzima de uma bactéria encontrada em gêiseres e em fontes quentes Thermus aquaticus chamada Taq DNA Polimerase (T-DNAp) que consegue obter um funcionamento adequado a temperaturas de 95ºC temperatura ao qual é nescessária para abrir os duplos filamentos do DNA, com isso é possível amplificar qualquer sequencia de DNA a partir de amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais, cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina). Amostras de microorganismos, células animais ou vegetais, alguns deles com milhares, possivelmente até milhões, de anos de idade podem, também, ser detectadas.

Para a execução do método PCR é necessário o conhecimento prévio da sequência do acido nucléico que se deseja amplificar, em mãos desse conhecimento utiliza-se dois “primers” que são uma pequena sequencia de nucleotídeos para iniciar o processo de síntese assim um primer vai para a sequencia de DNA no sentido 3’-5’ e o outro vai para a sequencia de DNA no sentido 5’-3’, e ao reconhecer o “primer” a T-DNAp sintetiza uma cópia complementar obedecendo a sequencia do DNA da amostra original assim a PCR necessita de deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que são quatro componente químicos diferentes que atuam na construção da molécula de DNA.

DNA Fingerprint através da técnica de RFLP

Como já sabemos as impressões digitais genéticas são muito úteis hoje em dia para diversas situações, como: confirmação da paternidade, analise de DNA de suspeitos de um crime, identificação de espécies, entre outras.

Aqui você irá encontrar um processo de como são produzidas as impressões digitais, através da técnica de RFLP (Restriction Lenght Polymorphism), a mais utilizada atualmente. A técnica de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição baseia-se no princípio que a sequência nucleotídica da molécula de DNA é exclusiva de cada indivíduo, exceto no caso dos gêmeos univitelinos, esta técnica permite estabelecer relações de parentesco entre diferentes indivíduos.

Passo a passo:

· Coleta-se o material, este pode ser sangue, saliva, secreções, urina, tecidos moles, pêlos com folículos, caspa, dente, ossos, etc. Destes, o sangue é o mais utilizado;

· O DNA é purificado através da utilização de métodos químicos (ex: fenol, chelex, etc.);

· Caso a amostra seja menor do que a necessária, utiliza-se a reação de polimerização em cadeia para obter cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente;