Método PCR

O método PCR na verdade possui uma função diferente do RFLP, ou seja, esses dois métodos podem se complementar o PCR serve para quando a amostra esta presente em pequenas quantidades, e assim utilizamos esse método para criar réplicas dessa amostra e aumenta o seu tamanho permitindo uma análise mais profunda (como por exemplo, o próprio fingerprinting do método RFLP). O nome PCR vem do inglês “Polymerase chain reaction” ou “Reação em Cadeia pela Polimerase”.

A técnica explora uma enzima de uma bactéria encontrada em gêiseres e em fontes quentes Thermus aquaticus chamada Taq DNA Polimerase (T-DNAp) que consegue obter um funcionamento adequado a temperaturas de 95ºC temperatura ao qual é nescessária para abrir os duplos filamentos do DNA, com isso é possível amplificar qualquer sequencia de DNA a partir de amostras de diferentes materiais biológicos como sangue, urina e outros fluidos corporais, cabelo e cortes de tecidos (biópsias frescas ou em blocos de parafina). Amostras de microorganismos, células animais ou vegetais, alguns deles com milhares, possivelmente até milhões, de anos de idade podem, também, ser detectadas.

Para a execução do método PCR é necessário o conhecimento prévio da sequência do acido nucléico que se deseja amplificar, em mãos desse conhecimento utiliza-se dois “primers” que são uma pequena sequencia de nucleotídeos para iniciar o processo de síntese assim um primer vai para a sequencia de DNA no sentido 3’-5’ e o outro vai para a sequencia de DNA no sentido 5’-3’, e ao reconhecer o “primer” a T-DNAp sintetiza uma cópia complementar obedecendo a sequencia do DNA da amostra original assim a PCR necessita de deoxinucleotídeos trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que são quatro componente químicos diferentes que atuam na construção da molécula de DNA.

Assim o PCR pode ser descrito em 5 etapas:

1)coleta da amostra, no caso da análise PCR é possível verificar se há alguma modificação no tipo de amostra especifico (por exemplo: se quisermos verificar lesões na pele, só será possível visualizar esse fato através do exame de DNA da pele).

2) extração do DNA da amostra que segue um critério de metodologia básico que varia dependendo da amostra, usando essencialmente substâncias desproteinizantes como o fenol-clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que estão acopladas ao DNA, e após a desproteinização vem a adição do etanol que fará a precipitação do material genético que posteriormente será solubilizado em tampão apropriado para o uso na reação.

3) preparar a mistura com o seguintes componentes: solução tampão para manter a mistura de reação no pH e condições iônicas ideais para a reação; os deoxinucleotídeos já mencionados; os “primers.”; a Taq Polimerase;o DNA extraído da amostra.

4)Nessa parte é feita a reação em si num termoscilador confome a imagem mostra.

Assim os possíveis problemas podem vir com a contaminação das amostras, que acarretará no clone de DNAs “estranhos” a amostra que levará a conclusões errôneas e a presença de substancia que inibem a reação podem ser outro problema (como exemplo a hemoglobina). Para isso a amostra deve ser devidamente tratada para “limpá-las” destas substâncias, com o devido cuidado com as amostras o método será realizado com sucesso permitindo a análise correta.